メタン生成菌 Methanococcus maripaludis のジアゾ栄養増殖に対する硫化物の影響とニトロゲナーゼの起源に対するその影響

Jul 18, 2023

Communications Biology volume 6、記事番号: 799 (2023) この記事を引用

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メタン生成菌は、黄鉄鉱などの金属硫化物として遷移金属の沈殿を促進するユーキシン（硫化物が豊富）または鉄（鉄が豊富）環境に生息し、金属または硫黄の利用可能性を低下させます。このような環境は地球の歴史を通して一般的であり、嫌気性生物が酵素補因子を合成するためにこれらの要素をどのように入手するかという疑問が生じています。今回我々は、メタン生成菌が鉄と硫黄の供給源として黄鉄鉱からモリブデンニトロゲナーゼメタロファクターを合成し、窒素固定を可能にすることを示す。黄鉄鉱で成長させた窒素固定細胞はより速く成長し、ユーキシン条件下で成長させた細胞よりも必要なモリブデンの量は 25 分の 1 です。増殖収量は、鉄含有条件下で増殖させた培養物では、優良な条件に比べて 3 ～ 8 倍高くなります。生理学的、トランスクリプトーム、および地球化学的データは、これらの観察が硫化物によって促進される金属、特にモリブデンによる制限によるものであることを示しています。これらの発見は、モリブデンニトロゲナーゼが、硫化物を滴定して黄鉄鉱を形成し、補因子の生合成に十分な鉄、硫黄、モリブデンの利用を促進する鉄含有環境で発生した可能性があることを示唆しています。

窒素 (N) は、あらゆる形態の生命における核酸、アミノ酸、その他の重要な生体分子の合成に不可欠です。地球上で最大の窒素貯蔵庫は大気中の二窒素 (N2) ガスです。ただし、生体利用可能ではないため、吸収される前に硝酸塩 (NO3-) またはアンモニア (NH3) に固定する必要があります。そのため、固定 N の利用可能性がエコシステムの生産性を制限することがよくあります1。初期の地球では、固定された窒素は、雷に基づく大気中の窒素の酸化や窒素の鉱物還元などの非生物的プロセスによって供給されたと考えられています2,3。しかし、これらの供給源からの固定 N は最小限かつ有限であり、これらの特徴が合わさって、この時期の生態系の生産性は制限されていると考えられています1。現在、全固定窒素の約 50% は N2 固定という生物学的プロセスを通じて生成されています 1,4。これにより、N2 は酵素ニトロゲナーゼ (ジアゾトロフィー) によって NH3 に還元され、残りの固定窒素の大部分は工業的なハーバー・ボッシュプロセスを通じて生成されます。

これまでに 3 つの異なる形態のニトロゲナーゼが記載されており、これらは各酵素複合体の活性部位を構成する (ヘテロ) 金属によって区別されます 5。これには、モリブデン (Mo)、バナジウム (V)、鉄 (Fe) のみのニトロゲナーゼ 6,7 が含まれます。 Mo-ニトロゲナーゼ (Nif) は、分類学的に最も広く分布し、最も古い形態のニトロゲナーゼ 8,9 であり、少なくとも構造タンパク質 NifHDK とマチュラーゼタンパク質 NifB(E)N10 から構成されます。 Nif の活性サイト金属クラスターは、6 個の鉄 (Fe) 原子と 9 個の硫黄 (S) 原子のコアで構成され、Fe が中心の炭素原子に対称的に配位しています。金属クラスターは、Fe および Mo 原子 [7Fe-Mo-9S] (FeMo 補因子と呼ばれます 10、11) によってキャップされています。 FeMo 補因子に加えて、Nif は 8 つの Fe 原子と 7 つの S 原子からなる複雑な P クラスター [8Fe-7S]12 を必要とします。 FeMo 補因子は各 NifD 構造タンパク質内に収容されていますが、P クラスターは各 NifD と NifK の界面に存在し、最終的にヘテロ四量体である NifD2K213 を形成します。ジニトロゲナーゼレダクターゼ、NifH は、NifD2K2 への ATP 依存性の電子移動を調節し、2 つの NifH サブユニットのそれぞれに追加の [4Fe-4S] クラスターを保持します 14,15。したがって、Nif を介して N2 固定を行う細胞は、Fe、S、Mo、ATP、および還元等価物に対する高い要求を持っています。

NifHDK タンパク質の連結の系統解析により、Nif の最も初期に進化した系統が水素栄養性メタン生成菌に見られることが示されています 6、7、8、9、16、17。これらの観察は、NifHDK が補因子 F43018,19 の合成に必要なタンパク質である CfbCD8 の祖先をコードする遺伝子の一連の重複から進化したことを示す他のデータによって裏付けられています。 F430 (および CfbCD コード遺伝子) が古細菌のメタン生成菌 (および古細菌のアルカノトローフ) にのみ存在すること 20 は、これらの古細菌の祖先における Nif の起源を示すさらなる証拠です。これらのデータは、古原生代中期〜18億〜21億年前（Ga）の嫌気性メタン生成菌の祖先におけるNifの起源を示唆するために使用されている6,9,17。ただし、頁岩に保存されている有機物の同位体データは> 3 Ga はさらに古い起源を示唆しています 21,22。実際の起源の日付に関係なく、ニトロゲナーゼは初期地球の無酸素環境で生まれた古代の酵素であると解釈されています。この酵素の無酸素起源は、Nif 機能に必要な金属クラスターの酸素感受性と一致しています 23。その後、Nif は嫌気性生物の間で多様化し、その進化の歴史の後期になって初めて、エネルギー代謝に酸素 (O2) を組み込むことができる、またはシアノバクテリアの場合は O2 を生成することができる生物間での水平遺伝子伝達を介して獲得されました。シアノバクテリアの増殖と O2 生産に伴う生物学的生産性の拡大は、固定窒素 24 の既存の非生物的プールに対する需要を増加させたであろう。これは、大気中の窒素 2 を減らし窒素制限を緩和する生物学的メカニズムを進化させるための選択圧であった可能性がある 7,25。

2.4 Ga)26,27. This is due to the circulation of hydrothermal fluids through iron-rich mid-ocean basalts, which led to input of a greater amount of Fe(II) into anoxic ocean basin waters than sulfide (HS-)28. In the absence of oxygen, the excess Fe(II) would have been stable, and free Fe(II) concentrations are estimated to have ranged from 0.05 to 0.5 mM29. However, the proliferation of Cyanobacteria and the production of O2 during the late Archean drove the oxidative weathering of continental sulfide minerals that increased the flux of sulfate into oceans. When combined with increased productivity near ocean margins30,31, this would have stimulated heterotrophic sulfate reduction and HS- production. In turn, this led to stratified coastal oceans that were oxygenated at the surface and were euxinic (anoxic and HS--rich) at depth30,31,32. In contrast, deeper ocean waters and those more distal from continental margins remained ferruginous26, due to lower productivity in the overlying water column, decreased availability of sulfate and subsequent heterotrophic sulfate reduction, and hydrothermal input of Fe26,33,34. HS- has a high affinity for Fe(II), resulting in the formation of low-solubility iron-sulfide minerals, including pyrite (FeS2)35,36,37. As such, in euxinic environments, concentrations of HS- exceed that of Fe(II), resulting in the titration and precipitation of Fe(II) as FeS2. Under these conditions, excess HS- is also available to complex with other thiophilic metals (e.g., Mo, Co, Ni), potentially rendering them less bioavailable33,34,38./p>

6 mM inhibits N2 fixation in stream sediments72. While this effect was attributed to the toxicity of HS- in cells responsible for N2 fixation, it is plausible that the added HS- influenced the availability of trace metals (e.g., Fe, Mo) required for N2-fixing cells62,73,74,75. A similar effect of HS- on metal availability in N2-fixing MmS2 cultures may explain the lower cell yields and increased expression of Mod genes observed in Fe(II)/HS--grown cells relative to those grown with FeS2. MoO42- is a thiophilic molecule that readily reacts with HS- to form soluble thiomolybdate (MoO4-nSn2-) species that can ultimately be incorporated in sulfide minerals, such as FeS271,76. Such thiolation reactions would be expected to occur under the sulfidic (2 mM) cultivation conditions typically used to culture methanogens77 and that were utilized herein for the Fe(II)/HS--grown cultures. These euxinic cultivation conditions potentially limited the availability of MoO42- such that it did not meet cellular demands./p>

400 nM MoO42- was required for growth with an optimum of 4000 nM42. These values are much higher than those required of other N2-fixing organisms. For example, aerobic, N2-fixing cyanobacteria such as Anabaena variabilis81, as well as anaerobic N2-fixing purple sulfur bacteria (PSB) inhabiting the interface of oxic/euxinic waters and that serves as a modern analog of the productive continental margins of Proterozoic oceans82, can be supported by less than 10 nM MoO42-. Interestingly, maximum N2 fixation for the PSB was maximal above the chemocline where HS- was near zero82. Thus, it seems incongruous that methanogens would require 40-fold more MoO42- than these organisms, despite ancestors of methanogens likely being where Nif originated6,9./p>1000 nM MoO42- was provided (Fig. 4d). Strikingly, cells provided with FeS2 grew well under all Mo concentrations tested, including when 0 µM MoO42- was added (Fig. 4c). After this experiment, abiotic reactors containing media and FeS2 (no MoO42- added) were analyzed by ICP-MS and were determined to have background (contaminant) Mo ranging from 10 to 30 nM despite using ACS-grade chemicals and acid-washed glassware. Thus, Fe(II)/HS--grown N2-fixing cells required >500 nM MoO42- to achieve near-optimal growth rates and yields whereas FeS2-grown N2-fixing cells required <30 nM MoO42-./p>10-fold lower than previously reported for this strain42. Further, MmS2 cells can achieve optimal growth rates and yields at MoO42- concentrations that are at levels ~100-fold lower than previously reported42. Despite similar growth rates for the FeS2 conditions at different MoO42- concentrations, there was a positive trend in the cell yield with increasing MoO42- that indicates higher MoO42- concentrations are still beneficial to these cells (Fig. 4d). These findings are consistent with other studies that have shown N2 fixation at low Mo concentrations with cells grown under non-sulfidic conditions81,82. Notably, the low levels (10-30 nM) of MoO42- shown to support N2 fixation herein are similar to the inferred Mo concentrations of Proterozoic oceans83,84,85). Other studies investigating Mo requirements for other methanogen species fixing N2 found 1 to 10 µM MoO42- to be the optimal concentrations86,87. There is one other example of methanogens fixing N2 at low (<10 nM) MoO42- concentrations; Nishizawa et al. showed that isolates of Methanocaldococcus and Methanothermococcus from a hydrothermal vent could fix N2 with as low as 5 nM or 1 µM MoO42-, respectively59. This indicates that different methanogen species within the same hydrothermal environment (at different temperatures) can have very different Mo requirements. Importantly, these past experiments were all performed in the presence of >1 mM HS-, necessitating a re-evaluation of methanogens’, and other anaerobes’, ability to access MoO42- in the absence of high HS-. These data support the hypothesis that N2 fixation via Nif is more efficient in low HS- conditions where Mo is more bioavailable./p> ~3 × 107 cells per mL by centrifugation in 50 mL centrifuge tubes (Globe Scientific, Mahwah, NJ) for 30 min at 4696 x g at 4 °C. The supernatant was removed using a line and needle under low-vacuum and the cells were resuspended in 8 mL of basal medium and transferred to a 15 mL centrifuge tube (Globe Scientific)./p>

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